传统抗癌策略（例如化学疗法和放射疗法）伴随着功效和不良副作用的长期存在的问题，迫切要求探索和开发新的高性能方法。近来，光热疗法（PTT）由于其最小的侵袭性，时空精确度，可复制的活性，对耐药性的忽略不计以及仅限于目标区域的光毒性的特殊优势而受到越来越多的关注。考虑到较低的生物毒性和较高的组织穿透深度，近红外光（NIR）始终用于PTT治疗。可以通过光敏剂（如吲哚菁绿，金纳米棒和硫化铜）通过振动松弛，表面等离振子共振或晶格结构将光能转换为热，并且可以在肿瘤部位有效地产生高热杀死肿瘤细胞。

为了改善光敏剂在肿瘤部位的蓄积，已开发出许多类型的纳米级载体，以利用肿瘤血管异常开口和缺陷引起的随机泄漏的增强的渗透性和保留作用。靶向配体的进一步功能化使得这些纳米载体能够进一步赋予对肿瘤细胞的活性亲和力，从而提供了优化抗癌潜能的潜力。

尽管有前途，基于纳米载体的PTT仍然面临一系列关键问题。例如，当前的主动靶向方法高度依赖于成功鉴定在肿瘤细胞上特异性表达的受体。不幸的是，癌症异质性，特别是在肿瘤发展过程中和/或在不同肿瘤和患者之间这些受体的不稳定和非均质表达，大大损害了靶向效率。此外，纳米载体在肿瘤内的渗透受到紧密的细胞外基质及其相关的异常高的组织间隙压力的限制。因此，在大多数情况下，完全消融大肿瘤非常困难。因此，为了改进这些方法，至关重要的是开发新的基于PTT的药物，这些药物应可靠地富集并渗透到肿瘤部位，并通过累加甚至协同作用显示出更高的治疗功效。

最近，血小板（PLT）已通过多种机制用作有效的抗癌载体，例如血管内皮粘附，手术损伤引起的聚集以及活化后分泌的纳米级囊泡。PLT用于通过血管粘附实现抗体向肿瘤的靶向递送，从而抑制了肿瘤的生长。在PTT方面，最近的研究表明，体温过高可以诱导肿瘤细胞释放抗原。这种反应不仅揭示了PTT潜在机制与免疫激活之间的内在联系，而且还鼓励将PTT与免疫疗法相结合以改善抗癌治疗。

受这些基于PLT的药物递送以及PTT与免疫疗法协同机制的研究的启发，中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室马光辉课题组报告了仿生PLT库用于联合癌症治疗的发展。在此结构中，将嵌段共聚物萘二酰亚胺-联噻吩衍生物（NDI-BT）设计为光热材料，然后合成光热纳米颗粒（N）并将其与免疫刺激剂R837盐酸盐（R）一起整合到PLT中，构造工程化的PLT（N + R @ PLT）。静脉注射后，N + R @ PLTs在血液中起循环前哨的作用，并对血管损伤具有敏感的反应。由于肿瘤组织附近的血管内皮细胞之间的连接总是被缺陷所削弱，因此一部分N + R @ PLT可以充当矛头来引发这些血管内皮细胞的粘附，从而最初将N + R货物转运至血管内皮细胞。

用NIR照射后，局部热疗会导致急性血管损伤，随后引起聚集级联反应，从而在肿瘤血管处形成阻塞。在这方面，有可能以更多依赖反馈的方式招募更多增强型PLT，从而使N + R货物的进一步积累能够就地形成。随后，在这些激活的PLT上进一步从质膜上产生纳米级前血小板（nPLT），这些前血小板将货物转移到深部肿瘤组织中，扩大了侵袭面积。PTT诱发肿瘤消融后，释放的肿瘤相关抗原的免疫原性会诱导人体对残留，转移性和复发性肿瘤的免疫应答。在免疫刺激剂R的帮助下，这种作用得到了显著改善。

该研究系统地验证了PLTs的上述优点以及N和R在体内的协同作用，并在9种不同的小鼠模型中证明了有效的治疗作用。最值得注意的是，该研究还证明了在基于人源化小鼠和患者源性肿瘤异种移植物（PDX）的复杂模型中，使用人PLT（hPLTs）的N + R @ hPLT  arsenal的功效。总之，这些结果显示了在高性能和抗癌联合疗法中使用仿生PLT平台的巨大前景。

题目：Near-infrared light–triggered platelet arsenal for combined photothermal-immunotherapy against cancer

期刊：science advances

影响因子：13.1159

PMID：33771861

通讯作者：马光辉

作者单位：中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室

索莱宝合作产品：

1.光热聚合物纳米粒子的合成

为了构建目标仿生N+R@PLT平台，作者制备了具有高光热转换效率的纳米粒子（图1A）。通过Suzuki反应[数-平均分子量（M_n）=163473；图S2A]。将这种位于疏水核中的光热共聚物和双硬脂酰磷酸乙醇胺（DSPE）-PEG的亲水聚乙二醇（PEG）段通过典型的共沉淀策略装饰表面构建了杂化纳米颗粒。所得纳米颗粒呈明确的球形，平均水动力直径约为50nm，具有明显的单分散性和表面负电荷（图1B和图S2、B和C）。此外，纳米颗粒对正常细胞的细胞毒性很小。确保了在体内给药的安全性（图S3、A和B）。

纳米颗粒具有高度一致的热稳定性和光稳定性。此外，在水介质中，这些纳米粒子产生明确的光声信号，其强度与纳米粒子浓度呈完美的线性关系（图1E），这意味着它们具有在体内引导光声成像的潜力。

2.N+R@PLTs的结构与特征

为了使光热纳米颗粒功能化，使其具有额外的PLT反应性和免疫原性，纳米颗粒被生物素修饰，而PLT膜上的CD42a被亲和素标记的抗CD42a抗体预处理。作者通过细胞切片透射电镜（TEM）成像检测PLT内部的纳米颗粒来验证CD42a分子可以促进纳米颗粒内化为PLT（图1F中的黄色箭头，与图S3C中的PLT相比）。在内化过程中，还引入了均匀分散在培养基中的免疫刺激剂R837盐酸，使得超分辨率PLT图像中同时存在N和R信号（图1G）。大约60个纳米颗粒和480万个R837盐酸盐分子被加载到每个PLT中（图S2E）。这种内化几乎没有影响PLT的大小和表面电荷，忠实地保留了光热光谱属性（图S2、C、F和图1H和I）。关于PLT生理学，红细胞与PLTs孵化后，没有观察到明显的溶血（图S3，D和E），说明其具有良好的生物相容性。此外，通过流式细胞仪（FCM）（图1J）和荧光成像策略（图S3F）评价N+R@PLTs激活后的聚集行为。而且作者发现，在二磷酸腺苷处理的N@PLT和N+R@PLT样品均显示出明显的聚集信号增加。这一发现与天然PLTs的特性反应性高度一致，说明PLTs在加载光热纳米颗粒和免疫刺激分子后仍保持其自然响应功能。

TEM图像进一步证明了这种反应性（图1K，左），显示静息态N+R@PLTs是圆形的，没有明显的伪足，而活动态N+R@PLTs变得更加树枝状和膨胀，类似于天然PLT。此外，激活导致生成丰富的nPLT，这也被TEM和扫描电镜（图1K，左插图，和图S3G）和FCM数据证实，显示高PLT标记物CD62P表达的纳米小泡信号增加（图1K，中）。在nPLTs中，观察到NDI-BT纳米颗粒（N）（图S3H）。同时，N和R的特征信号也在nPLTs中被识别出来（图1K，右），这表明这两种成分可以被nPLTs捕获，以便进一步的转运。

3.体内靶向和光热性能

在成功构建了N+R@PLTs后，作者移植了4T1三阴性乳腺癌肿瘤的小鼠在体内研究了它们的命运和表现（图2A）。作者以低功率进行单次近红外照射。静脉注射后，N+R@PLTs的循环时间与天然PLTs相似，远远长于裸光热纳米颗粒（图S3，I和J）。这种相对较长的持续时间促进了N+R@PLTs在血液中作为循环哨兵的功能。

由于PLT上的粘附受体（如C型凝集素样受体2、细胞间粘附分子1和糖蛋白）和血流中的“血小板边缘”效应，N+R@PLTs对肿瘤附近的血管损伤具有天然敏感性。结果表明，少数N+R@PLTs先锋到肿瘤部位，峰值时间为1小时（图S4、A、B）。局部近红外光辐照1小时后，信号强度逐渐增加，峰值时间延长至8小时（图2B和图S4B）。利用这些纳米粒子的光声特性，通过光声成像也观察到了类似的结果。例如，经过10分钟的照射治疗后，肿瘤部位的光声信号比初始信号增加了10倍，这表明由于局部热疗引起的急性血管损伤，N+R@PLTs积累了更多的量（图2C）。为了验证，作者通过多光子共聚焦显微镜评估了N+R@PLT的命运（图2D），结果显示，最初，第一个检测到的N+R@PLTs附着在肿瘤血管壁，这归因于它们与肿瘤血管内皮细胞的亲和力。近红外照射后，可观察到肿瘤血管闭塞，提示有大量N+R@PLT聚集。

考虑到PLTs激活后分泌的nPLTs可以从肿瘤血管外渗，并进一步渗透到肿瘤深处（图S4C），因此，这些纳米囊泡中的N和R物质可以运输到肿瘤深层组织中，这可以通过免疫组化（IHC）肿瘤切片中N和R信号的共定位来证实（图2E）。这种自我强化和子代在肿瘤周围产生了强大的武器，除了提供一种机制来克服对肿瘤内浸润的抵抗，这阻碍了传统的细胞介导的传递系统。扩张的攻击区域导致了实体肿瘤的强效热疗（图2F）。与自然PLT组的稳定温度相比，N（L）组由于靶向性较差，在10min内温度出现了适度上升（至44℃）。值得注意的是，作者观察到 N+R@PLT组，温度迅速增加到56°C（图S3K），导致热休克蛋白（HSP）在肿瘤组织中表达最高（图2G）。

4.光热治疗后的免疫反应

作者还评估了PTT引起的免疫反应（图3A）。考虑到细胞因子作为免疫反应指标的效用，监测了白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-ɑ（TNF-ɑ）的血清水平（图3B）。N（L）处理对细胞因子产生的影响很小，因为N在肿瘤部位的积累较低，随后的光热效应较低。由于激光照射诱导的PLT聚集改善了肿瘤的积聚（图S4、D和E），随后光热效应增强（图2F和图S3K），N@PLTs（L）组的这种效应得到了改善。在N+R@PLT组，无激光照射排除局部热疗效应，细胞因子中度升高仅归因于负荷R。这两个方面的协同作用下，N+R@PLTs（L）组IL-6和TNF-ɑ的水平进一步增加，但仍在正常范围内，表明引发了安全有效的免疫反应。

作者选择血清细胞因子水平在第3天达到峰值这个时间点对肿瘤引流淋巴结（TLN）进行详细研究，TLN位于肿瘤的直接下游，可以从免疫抑制重构为免疫刺激，用于抗癌免疫治疗。如图3C所示，在对照组中几乎未检测到肿瘤抗原（TA）的征象，而在N-based PTT[N（L）]组中仅发现少量信号。相比之下，PTT单方式治疗[N@PLTs（L）]或免疫刺激（N+R@PLTs）可在树突状细胞（DCs）中产生更多分散的TA信号。联合处理[N+R@PLTs（L）]，大量暴露的TA被转运到TLN，增加了树突状细胞的摄取，伴随着最高水平的树突状细胞成熟（图3D中由CD80和CD86表示）。相应地，通过Ki67染色，作者检测到整个TLN中存在大量的免疫细胞增殖（图3E）。CFSE进一步定量显示，N+R@PLTs（L）组中有84.9%的CD8⁺T细胞增殖，而其他组的增殖效率在40%以下（图3F）。结果表明，在N+R@PLTs（L）组中，更多来自免疫刺激TLN的CD8⁺T细胞浸润到肿瘤中（图3G），表明其优越的免疫治疗效果补充了PTT的性能。

5.对各种小鼠肿瘤模型的治疗作用

作者系统地评估了PLTs在不同小鼠模型中的治疗效果，以确定这种治疗是否能够适应广泛的临床抗癌需求。安全性评估研究表明，在荷瘤小鼠或非荷瘤小鼠的器官、血清、凝血能力、温度和体重中观察到很少异常（图S6和S7），从而证实了作者制备的仿生PLT制剂的安全性。

为了进一步证实工程化PLTs对光热抗癌疗法的优越性，作者将一种典型的光热剂Au纳米棒（A）纳入了比较，该试剂被PLT膜包裹（A@PM）或根据先前报道的基于PLT的配方装载到整个PLT（A+R@PLTs）中（图S8）。A+R@PM、A+R@PM（L）、A+R@PLTs（L）三组均加入相同的佐剂盐酸R837，以匹配联合免疫治疗（图S8、A、B）。A+R@PM（L）和A+R@PLTs（L）的治疗效果均显著低于N+R@PLTs（L）（图S8，C至E）。更大的成功在于对N+R@PLT-based PTT配方[N+R@PLTs（L）组]进行了以下改进：首先，光热材料NDI-BT纳米颗粒表现出更高的光热转换效率（图S8，F to H）。因此，与A+R@PM（L）组和A+R@PLTs（L）组相比，单次低功率近红外照射可有效诱导N+R@PLTs（L）组的局部热疗（图S8I）。更重要的是，整个PLT方案显示在自然的PLT激活下，肿瘤血管高效靶向聚集级联，并以反馈依赖的方式不断累积到局部热疗引起的急性血管损伤部位。此外，与基于粘附的策略相比，肿瘤部位PLT库分泌的nPLT“后代”表现出了强穿透深层组织的能力。相比之下，A+R@PM（L）组的包膜缺乏自我强化和nPLT产生的能力，而仅通过粘附策略靶向肿瘤血管（图S8J）。

为了模拟更先进的转移过程，作者建立了一个血行转移模型进行进一步的研究。通常情况下，移植了4T1肿瘤的小鼠在第7天接受不同PLT配方的单一治疗，然后在第8天再次静脉注射4T1细胞（图4F）。由于这些4T1细胞预先表达了荧光素酶（标记为Luc-4T1），通过检测生物发光可以同时监测原发肿瘤和肺转移的发展（图4，G和H）。光热[N@PLTs（L）]和免疫（N+R@PLTs）单独治疗组对原发性肿瘤和肺转移信号的抑制均有中等效果。相比之下，N+R@PLTs（L）联合治疗导致原发部位和转移部位的生物发光信号消失（图S9A），表明肿瘤细胞在全身被完全根除。相应的，N+R@PLTs（L）治疗组在100天后的存活率为100%，而其他治疗组的小鼠均在4~7周内死亡（图4I）。

为了进一步探索在物理远端肿瘤中激活光热-免疫协同作用的潜力，作者继续使用双肿瘤模型（图5A），其中单侧肿瘤接受了不同PLT配方的单一治疗。历史上，这种双肿瘤模型为传统的光热治疗策略提出了一个挑战性的障碍，因为这些治疗通常需要直接获取近红外源来进行有效的治疗。作者发现，在低功率的单一近红外照射条件下，N@PLTs（L）治疗仅在原发肿瘤和远端肿瘤部位诱导了中度抑制肿瘤发展的作用（图5B），这与在N+R@PLT免疫刺激小鼠中观察到的相似。相应地，这两组小鼠在大约第40天迅速死亡。相比之下，N+R@PLTs（L）组原发肿瘤和远端肿瘤均被完全抑制，所有小鼠在第100天后仍然存活，这表明协同作用必须达到有效的治疗效果（图5C）。考虑到免疫反应通常与一种典型的持久记忆效应相关，这对良好的癌症预后至关重要，继续评估PLTs诱导的长期抗癌免疫（图5D）。作为对照，用4T1细胞攻击健康小鼠可诱导肿瘤快速发展，并在随后的4周内逐渐死亡（图5E）。当小鼠被移植4T1肿瘤时，接受N+R@PLTs（L）单次治疗后，作者观察到脾中效应记忆T细胞显著增加，甚至在50天后（图5F）。在建立长期免疫记忆后，随后用4T1肿瘤细胞再次处理后，对侧腹的肿瘤形成完全抑制，100天存活率为100%（图5G）。

手术切除后残留的肿瘤细胞经常导致肿瘤复发，是临床常见的问题。为了解决这个问题，作者接下来研究了PLT平台在预防术后复发方面的适用性。为此，作者通过手术切除大部分原发肿瘤建立了复发模型（图5H）。相应的，手术后治疗组间剩余的Luc-4T1细胞信号强度几乎相等。与前期实验一致，PBS组的生物发光信号在随后的2周内继续扩散，恶性肿瘤复发，患者的生存率为0%（图5I）。然而，N+R@PLTs（L）方案在手术不完全切除后立即实施，残余生物发光信号在1周内完全消失（图S9B）。相应的，所有小鼠都保持无肿瘤，在长期（100天）观察期间存活率为100%。除4T1乳腺癌外，作者还在CT26结直肠癌、B16黑色素瘤、Lewis肺癌（LLC）和肝癌-22（H22）模型中验证了这种有效的抗复发作用，从而验证了基于PLT仿生平台的抗癌功效的普遍性（图5， J 到 M）。

6.构建基于hPLT的制剂并在复杂的人源化PDX模型中验证疗效

为了进一步证实作者的PLT平台